Nature：p53药物研发，艰难前行

当罗氏的科学家Lyubomir Vassilev在2003年开始写有关他的团队发现了抑制 p53 – MDM2 相互作用的小分子抑制剂的文章时，他已经预测到，这篇论文会引发热议。因为，p53是人类癌症中突变最频繁的基因，而他的团队已经发现了能够选择性增强该肿瘤抑制因子活性的化合物。

为了纪念这一里程碑发现，Vassilev并没有使用难以理解的公司代码来命名这一新化合物，而是将它们命名为nutlins，因为这类化合物是在位于新泽西州Nutley的工厂发现的。

Vassilev团队的这项成果最终在2004年发表于Science杂志上[1]，不仅首次让业界了解了一个在罗氏已经运行了20多年的项目，同时，也吸引了赛诺菲、默沙东等竞争者布局p53药物的研发。它重新激发了工业界开发调控蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)的潜力药物的兴趣。

2020年对nutlins来说可能是另一个具有里程碑意义的一年，因为罗氏原定于在今年公布新一代nutlin（即idasanutlin，RG7388）针对急性髓系白血病(AML)的III期试验数据不久后就提交监管申请。然而，在今年6月的EHAC上，罗氏宣布该III期试验（MIRROS）失败了。

其他公司也在靶向p53和MDM2相互作用的小分子药物研发方面遭遇了挫折。诺华在1月份披露，公司将停止用于AML的siremadlin(HDM-201)的开发；安进已经将其临床候选分子AMG-232授权给Kartos Therapeutics进行进一步开发。此外，在过去10年里，强生、赛诺菲和默沙东都暂停了这方面的项目。

一些学术研究人员也正在抛弃p53。「我们实际上已经关闭了MDM2项目，因为我们认为这可能是一条死胡同。」研究MDM2靶向小分子已有十年的药物化学家Lukasz Skalniak说。

不过，也有一些人仍在坚持，他们坚信能够攻克这个「不可成药」的靶点。因为，尽管小分子药物停滞不前，但随着订书肽（stapled peptides）、靶向降解剂以及基于mRNA的药物不断发展，也许靶向p53–MDM2还有希望。

一、p53的吸引力

p53是一种复杂的蛋白质，以前一直被误解。首次发现于1979年，因根据SDS-PAGE分析其分子质量为53 kDa被命名为p53，但它的实际质量是44 kDa。虽然研究人员最初认为它是癌症发展的致癌驱动因素，但直到后来他们才意识到p53实际上是一种强大的肿瘤抑制因子，可以抑制初生的癌细胞。在检测到DNA损伤后，p53信号会导致细胞周期延迟，使细胞能够修复损伤，或者在DNA损伤已经太严重时直接诱导细胞凋亡。

长期以来，p53一直是一个引人注目的癌症靶点。携带p53某些遗传性功能缺失突变的个体，有50%的几率在30岁时患上癌症，有90%的几率在70岁时患上癌症。敲除p53的小鼠很快就会出现肿瘤。高达50%的癌症p53的两个等位基因都发生了突变。药物研究者推测，能够重新激活p53肿瘤抑制能力的药物可能具有强大的抗癌活性。

然而，相比激活蛋白，抑制它们更加容易。p53与MDM2的相互作用提供了一个关键途径(图1)。MDM2不仅可与p53结合，以阻断其肿瘤抑制反式激活域，这一蛋白本身还是一种E3连接酶，可标记p53，使其被蛋白酶体降解。通过阻断p53与MDM2之间的相互作用，研究者们希望，携带野生型p53的患者能够恢复p53的抑癌活性。

然而，靶向蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)也有自己的挑战。这种互相作用大而平的表面为配体提供了非常少的立足点，且大的蛋白质「伙伴」通常不受试图将它们分开的小分子的影响。据曾在罗氏从事nutlins相关研究10多年的Bradford Graves回忆，到上世纪90年代末，当罗氏开始着手研究p53项目时，该公司其实已经对PPIs持悲观态度。不过，由于MDM2的PPI界面上有一个很深的疏水性凹槽，这是一个比较明确的口袋，诺华公司已经开发出针对这种口袋的小合成肽，因此，罗氏公司将其疑虑搁置一边。

尽管p53项目一开始进展缓慢，但Graves及其同事最终找到了「nutlins」。

Graves认为，这不仅是MDM2拮抗剂领域的重大进展，也是PPIs领域的重大进展。

MD Anderson癌症中心的肿瘤学家Michael Andreeff也认为这是一件了不起的事情。「我印象非常深刻，当我在Science杂志上看到它时，我跳了起来。」他回忆道。

Andreeff在一次会议上遇到了Vassilev，随后与Roche合作进行nutlins的试验。

二、MDM2抑制剂的临床开发

不过，尽管多年来，许多制药公司对MDM2抑制剂进行了大量投资，但这些小分子 PPI阻断剂 尚未在临床应用。

第一个进入临床试验的MDM2抑制剂是罗氏的RG7112, 它是nutlin家族的优化成员。针对实体瘤和血癌的I期试验分别在2007年和2008年启动。Andreeff是血癌试验的首席研究员，他对RG7112治疗AML非常乐观。因为，虽然p53在大约50%的癌症中发生突变，但仅在5%-10%的AML患者中发生突变。因为患者需要携带野生型p53才能获益于MDM2抑制剂，因此，AML的这种特征使得MDM2抑制剂更有几率有效。此外，MDM2在AML中经常过表达。

遗憾的是，在他们的试验中，RG7112必须以非常高的剂量进行给药，且会导致胃肠道毒性，中性粒细胞减少和血小板减少。Andreeff和他的合作者认为需要一种更有效的MDM2抑制剂。

Idasanutlin（之前称为RG7388）担任了这个角色。与nutlin相比，这个小分子有了不同的化学骨架。然而，idasanutlin的临床疗效也不尽如人意。

自2011年首次开展人体试验以来，罗氏已经在不同的疾病中试验了多种基于idasanutlin的联合治疗方案。唯一进入III期的方案是idasanutlin联合化疗药物阿糖胞苷（cytarabine），用于治疗复发或难治性AML。但是在今年6月，该试验也因中期分析数据不佳而终止了。罗氏之前也在开发idasanutlin用于AML一线治疗，但试验也停止了。

三、联合治疗

很多人对idasanutlin的失败并不感到惊讶，因为一些其它MDM2抑制剂也止步临床研究。

早在2006年，研究人员就意识到，MDM2抑制剂并不总是会诱导p53野生型癌细胞凋亡，这可能是由于下游信号通路失效所致。最初对MDM2抑制剂敏感的细胞随着时间的推移也会产生耐药性。

想要继续研究p53激活剂的研究人员似乎需要找到其他策略。一种可能的解决办法是联合治疗。

然而，与「谁」联合呢？困难又来了。

「如果你观察这一蛋白质的信号传递和相互作用途径，它似乎与一切都有联系，其生物学是极其复杂的。」默沙东的高级首席科学家Anthony Partridge解释道。

如下表所示，这些年业界已经提出了几十种组合策略，化疗、抗生素、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和治疗性抗体，各种尝试都有。一些研究已经失败了，一些研究还在进行中。

Andreeff最喜欢的是MDM2抑制剂与阻断BCL-2的venetoclax的结合。他2017年在Cancer Cell发表的一篇论文证实，这些药物可以协同作用[2]。p53可驱动MCL-1降解，从而克服了对venetoclax耐药的主要机制，而BCL-2抑制剂促进了p53驱动的细胞凋亡。

罗氏和艾伯维正在合作测试这种组合，Andreeff是研究人员之一。初步的I/II期结果显示，缓解率为40%–50%。这项试验正在进行中。

随着对p53理解的不断发展，其他策略也在兴起。由于p53在肿瘤免疫中的作用（癌细胞可通过p53上调PD1和PD-L1的表达；p53的活性也会增加抑制T细胞活性的DD1α分子的表达），MDM2抑制剂作为免疫调节剂的潜力尤其受到关注。

「p53或许可以被称为免疫系统的主要调节因子。」Andreeff说。

有几家公司正在探索这种新的联合方向。Boehringer Ingelheim正在测试其MDM2抑制剂BI 907282与PD-1阻断剂BI 754091和LAG3阻断剂BI754111的结合。诺华正在进行MDM2抑制剂siremadlin与TIM3靶向抗体MBG453联合使用的试验。一个学术小组正在试验MDM2抑制剂与PD-1抗体atezolizumab的联合使用。Ascentage Pharma（亚盛医药）正在进行其MDM2抑制剂APG-115联合PD-1抗体pembrolizumab的I期试验。

Partridge认为，整个领域都将密切关注这些免疫肿瘤学试验的结果。如果有试验成功，会有更多人开展同类研究。

四、订 书 肽

MDM2小分子抑制剂失败的另一种可能的解释是，这些化合物可能太过专一而无法充分重新激活p53。因为，除了MDM2能够沉默p53，与MDM2结构上相关的MDMX也可以结合并阻断p53的活性。

爱因斯坦医学院的细胞生物学家Ulrich Steidl认为，双靶向途径是成功的关键。

基于肽的策略目前在这方面处于领先地位。

p53有一个螺旋状区域可以同时结合MDM2和MDMX，这个螺旋状区域为可以结合这两个靶点的模拟肽的设计提供了模板。虽然多肽不能很好地穿透细胞，但数十年来，研究人员一直试图证明，螺旋状构象的订书肽(Stapled Peptide) 的稳定性、细胞通透性和有效性有望使其成为一种新的治疗方式。

Aileron Therapeutics的ALRN-6924是临床开发走得最快的订书肽，该肽是MDM2和MDMX的双重抑制剂，最初是与罗氏的研究人员合作开发的，但罗氏在2013年底退出了合作。

Steidl认为订书肽应该得到更多的关注。在发现MDMX在AML中高度过表达后，他开始寻找可使用的MDM2和MDMX双重抑制剂，以便进一步理解它们与p53的相互作用。

Aileron向Steidl提供了ALRN-6924。在2018年，Steidl在Science Translational Medicine报道，该订书肽具有显著的抗白血病作用[3]。

由于订书肽先前曾遭受质疑，因此很多公司放弃过相关项目，而最近几年一些公司正在重新投资订书肽。默沙东正在与其合作伙伴一起对靶向MDM2和MDMX的订书肽进行优化，希望最终能推动这种疗法的发展。领导这项工作的Partridge说:「我认为，我们正面临一个转折点，一旦一些关键问题变得清晰，我们就可以用订书肽认真地寻找靶点。」

五、蛋白降解剂

靶向降解剂可能提供了另一种重新激活野生型p53的方法。这种双功能分子的一端与兴趣蛋白（即靶蛋白）结合，另一端与E3泛素连接酶结合。而E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白。之后，细胞的蛋白粉碎机（即，26S蛋白酶体）会识别和降解被标记的靶蛋白。

nutlins在这一新兴技术的发展早期扮演了一个角色。耶鲁大学的Craig Crews教授和他的同事在2008年发现的第一个小分子靶向降解剂（一种PROTAC）使用nutlin招募MDM2来启动降解级联。

2018年发表于Cancer Research上的一项研究中[4]，Crews教授团队描述了使用idasanutlin作为E3连接酶招募者的一种PROTAC分子，研究发现，该分子具有双重抗癌作用机制：不仅能够使BRD4降解，还可通过阻断p53与MDM2的相互作用重新激活p53。

密歇根大学的药物化学家Shaomeng Wang也在用靶向降解剂重新激活p53，但方式不同。他的团队通过将spiro-oxindole与Cereblon E3连接酶配体lenalidomide结合得到了MD-224。该分子可诱导MDM2的快速降解，重新激活p53。相关成果于2019年发表在Journal of Medicinal Chemistry上[5]。

Shaomeng Wang正在寻找机会将其MDM2靶向降解剂项目推向临床研究。「我认为MDM2降解剂可能比MDM2抑制剂更有效。」他说。

六、mRNA疗法

一些其它方法也在推动基于p53的药物研发。比如，最近发表在Science Translational Medicine上的一篇论文中，有研究人员展示了，基于mRNA的疗法可能具有治疗携带p53突变的癌症的潜能[6]。来自哈佛医学院Jinjun Shi及其同事使用基于纳米颗粒的方法将p53 mRNA传递到p53缺失的癌细胞中。这导致了功能性p53在这些细胞中的表达，延缓了癌细胞的生长。当将这种方法与mTOR抑制剂everolimus联合时，在动物疾病模型中，他们看到了显著的抗肿瘤效果。

「p53可以说是人类癌症中最重要的靶点，所以我希望科学家们会继续对它感兴趣，并继续应用新的方法来解决它。」 Partridge总结道。

备注：本文编译自Nature Reviews Drug Discovery上题为「p53 programmes plough on」的报道。

参考资料：

[1]Lyubomir T. Vassilev et al. In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-Molecule Antagonists of MDM2. Science(2004).

[2] Rongqing Pan et al. Synthetic Lethality of Combined Bcl-2 Inhibition and p53 Activation in AML: Mechanisms and Superior Antileukemic Efficacy. Cancer Cell(2017).

[3]Luis A Carvajal et al. Dual inhibitionof MDMX and MDM2 as a therapeutic strategy in leukemia. Science Translational Medicine(2018).

[4]John Hines et al. MDM2-Recruiting PROTAC Offers Superior, Synergistic Antiproliferative Activity via Simultaneous Degradation of BRD4 and Stabilization of p53. Cancer Research(2018).

[5]Yangbing Li et al. Discovery of MD-224as a First-in-Class, Highly Potent and Efficacious PROTAC MDM2 Degrader Capableof Achieving Complete and Durable Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry(2020).

[6]Na Kong et al. Synthetic mRNA nanoparticle-mediated restoration of p53 tumor suppressor sensitizes p53-deficient cancers to mTOR inhibition. Science Translational Medicine(2019).

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