科技猎干扰细胞内 DNA 修复机制能提升 CRISPR 效率?
【Technews科技新报】 CRISPR-Cas9 系统做为近年来最热门的基因编辑技术，广泛的在学术界被运用于研究中，能够剔除人类细胞株中的特定基因，并以此找出该基因的功能，但这项技术有个美中不足之处，就是它剔除不同基因时的效果有很大的差异。
在 8 月 17 日发布于网络科学期刊 Nature Communications 的研究中，来自美国加州大学柏克莱分校的研究团队找到了新方法，在各种人类细胞中能够提升 CRISPR-Cas9 剔除（knockout）基因的效率至原先的 5 倍，使得基因剔除变得更加容易，并且有机会让突变基因无法运作，借此做为医疗方法。
科学家不断地透过各种实验技术在生物系统内发现新基因，以及他们所转译出的蛋白质，但真正困难的工作是，找到这些基因以及蛋白质在生物体内或疾病的 形成中所扮演的角色。要找出一个基因或蛋白质的生理功能还有角色最好的办法，就是将它从生物体内移除，看生物运作有什么改变，借此来抽丝剥茧找出它可能扮 演的角色，最后再以其他实验方法验证。
自从 CRISPR 基因编辑技术出现之后，这项技术使得科学家在进行研究时，能用更短的时间就将特定的基因从细胞株中移除。在这个过程中，研究者必须要不断地尝试各种基因编 辑工具，找到效果最好且最适合的才方便实验的进行。由于研究中使用的稳定细胞株大多来自癌化的细胞，这些癌化细胞株的每个基因数目，通常会比一般细胞多出 两倍以上，使得基因剔除在这些稳定的癌化细胞株上的难度更高，这项技术改良将能大幅提升进行此类研究的效率。而在这项研究中，研究团队所找到的方法能让这 个过程简单而快速许多。
这项技术的关键在于将 CRISPR-Cas9 蛋白质和低聚核苷酸（oligonucleotides）一起送入细胞中，这里用的低聚核苷酸是一种短 DNA 序列，不会和人类基因组中任何片段结合，能够干扰细胞内的 DNA 修复机制，使 CRISPR 所进行的基因编辑效率随之提升。
这项研究的首席研究员是身为加州大学柏克莱分校 Innovative Genomics Initiative（IGI）科学长以及分子及细胞生物学兼任助理教授的 Jacob Corn，他表示，在加强了这项技术之后，剔除特定基因变得非常容易，只要将不会和人类基因结合的合成低聚核苷酸送入细胞中，就能够将基因修改的效率提升 5 倍之高，尤其合成的低聚核苷酸成本也不高，这样的技术使得原先难以执行甚至根本无法成功的 CRISPR-Cas9 运用效率大幅提升。
提升 DNA 修复出错的机会
一旦基因编辑效率提升，科学家们在进行需要基因剔除实验的成功率也就随之提升，接着就能使用剔除特定基因的细胞株进行研究，对于基因功能方面的研究 有很大的助益。除了在研究技术上的运用，将这项技术用于剔除遗传的基因突变也能有所助益。内科医师推测特定基因的剔除，会使人们更容易患有某些如艾滋等传 染性疾病，或者更容易患有自体免疫失调、发炎症状或者神经退化失调。虽然这方面的应用仍有待未来进一步研究，但目前这项改良技术的高效率已经对研究有许多 助益。
CRISPR-Cas9 系统中，Cas9 蛋白质所扮演的角色就像一把专门裁切 DNA 的剪刀，并且根据指示在特定的位置进行截切。负责指示 Cas9 截切位置的是一种被称为向导 RNA 的短 RNA 片段，大约由 20 个核苷酸分子所组成，这一小段核苷酸序列和截切的目标基因序列互补，能够和目标 DNA 结合，再让 Cas9 蛋白质得以靠近，并将目标基因的双股 DNA 结构剪开。
在进行截切时，细胞内的修复系统将裁切的切口重新补起来，但是细胞内的修复系统并不是每次都能正确的运作，当修复系统出错时，DNA 序列就会出现突变，可能造成对应的基因失去功能，进而剔除基因活性。
自从 CRISPR 技术在 2012 年被来自加州大学柏克莱分校的 Jennifer Doudna 及瑞典于默奥大学的 Emmanuelle Charpentier 发明以来，不同条件下的效率差异一直都困扰着科学家们。有些向导 RNA 有很好的效果，能够帮助 Cas9 几乎百分之百的将目标基因剔除；而有些却正好相反，有些向导 RNA 剔除基因的效率非常低，甚至连和目标基因结合都有困难。除此之外，在不同细胞株中基因剔除的效率差异很大也是问题之一。
根据 Corn 的推测，Cas9 在某些状况下剔除基因的效率较差或许和 DNA 的修复方式有关。DNA 修复相关的蛋白质在细胞中稳定的表达，能够修正 DNA 上任何断裂或者缺失，避免细胞因为突变而死亡。但 DNA 修复系统在每种细胞中都不尽相同，而细胞中随机的 DNA 序列可能会扰乱修复系统，并影响成功机率，也就是说研究团队必须得要想办法避免细胞内的修复系统作用。
Corn 形容 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在细胞内的作用不断的和细胞本身的 DNA 修复机制竞争，每当 Cas9 在 DNA 上制造一个切口，细胞就会立即把切口补上，Cas9 再切一次，切口又再次被补上。这样不断重复的截切再修复循环，最后通常会因为修复系统终于出现错误，用错误的序列修复切口而造成突变，进而导致基因丧失原 先的功能，这样的循环才会停止。而在这项研究中加入低聚核苷酸或许就是因为它能够干扰细胞内 DNA 修复系统的准确度，或者迫使细胞采取较容易出错的修复机制，借此帮助 Cas9 能够更有效率的进行 DNA 截切。而研究团队的下一个目标，就是想办法提升 DNA 修复出错的机会，提升插入基因序列的效率，使得未来将有缺陷的致病基因能够被修改以正常的基因取代，借此治疗基因疾病。
- CRISPR-Cas9 breaks genes better if you disrupt DNA repair
（首图来源： Pixabay ）